Desarrollo de un modelo de cáncer oral en ratas y determinación de células inmunes (mastocitos) en el area peritumoral

 

AUTORES: Zavala Walther, Cavicchia JC, Foscolo M.

Facultad Odontología. UNCuyo, Mendoza, Argentina

Title
Development of a model of oral cancer in rats and morphology determination of immune cells (mast cells) in the peritumoral area.

Keywords
oral cancer, immune cells, mast cell.

Summary
In the global statistics, oral cancer accounts for 2 to 5% of patients and is responsible for 1% of cancer deaths. Almost 300 000 new cases of oral cancer are worldwide diagnosed each year .Several models of animals squamous cell carcinoma have been developed in laboratory, including: hamsters, rats and mice, each with advantages and disadvantages. Currently, the hamster cheek is a widely used model, creating tumors by the application of DMBA (7,12-dimethlbenzantranceno), which has the disadvantage that the tumors produced are not equal to its human counterpart .Another frequently used substance is 4-NQO (4-nitroquinoline-1-oxide). This model has been used both in rats and mice to study the effect of antitumor substances On the other hand it is known that immune cells, like dendritic and mast cells , are found in large numbers around squamous cell tumors, but no reference was found to correlate with the morphology of mast cells in early tumor dysplasia in tongue. Our faculty has not developed an experimental model of oral tumors in laboratory animals yet. Because of the need to investigate and develop new therapies, both in vitro and in vivo, is that this research raises whose primary objective is: Develop a model of oral cancer in rats, and the secondary objective: Determine the relationship between mast cells morphology in the peritumoral area with "early squamous cell dysplasias".

Introducción

Según la OMS el cáncer bucal representa del 2 al 5% del total de pacientes oncológicos y es responsable de 1% de las muertes por cáncer. Cada año se diagnostican 275.000 casos nuevos de cáncer oral en todo el mundo (1). Los principales factores de riesgo para el desarrollo de cáncer oral son: el tabaco y el alcohol (2). Los tratamientos empleados en la actualidad: cirugía, radioterapia y quimioterapia, solos o combinados, no han demostrado avances en el aumento de sobrevida (3). Se han desarrollado varios modelos, en animales de laboratorio, de carcinoma de células escamosas, incluyendo: hámsters, ratas, y ratones, cada uno con sus ventajas y desventajas. Los primeros experimentos inducían tumores por daño en la mandíbula de ratones (4).En la actualidad, la mejilla del hámster es un modelo ampliamente utilizado, creándose tumores por la aplicación de DMBA (7,12-dimethlbenzantranceno), el cual tiene la desventaja de que los tumores producidos no son iguales a su contraparte humana (5). Otra sustancia utilizada con frecuencia es el 4-NQO (4-nitroquinoline-1-oxide) introducido por Wallenius and Lekholmen 1973 (6), para inducir tumores en ratas. Este modelo ha sido utilizado tanto en ratas como en ratones para estudiar el efecto de sustancias antitumorales (7).Su principal desventaja es que implica un largo proceso de varios pasos para llegar al desarrollo de un carcinoma epitelial invasor, pero como ventaja trascendente se puede lograr un carcinoma, en ratones, con características similares a los desarrollador por los tumores de mucosa oral humana (8). Por otro lado existen evidencias que indican de la presencia de células cebadas (mastocitos) alrededor de los tumores avanzados de mucosa oral, lo cual coincidiría con su efecto angiogenico y potencial aumento de la diseminación de estos tumores (9-10); aunque su rol en las lesiones displásicas iniciales de la mucosa lingual permanece incierto. Nuestra facultad no ha desarrollado ni posee un modelo de experimentación de tumores orales en animales de laboratorio. Debido a la necesidad de investigar y desarrollar nuevas terapias tanto in vitro como in vivo, es que se plantea este trabajo de investigación cuyos principales objetivos son: Desarrollar un modelo de cáncer oral en ratas y Determinar la morfología y características particulares de las células cebadas (mastocitos) en el área peritumoral de lesiones tumorales iniciales de mucosa lingual.

Formulación y fundamentación del problema a investigar

Este trabajo se fundamentó en la importancia creciente en determinar los factores generales y aquellos que son propios del ambiente bucal, que llevan al desarrollo la progresión de lesiones neoplásicas en la cavidad oral. Es posible también pensar que este proyecto servirá de base para el desarrollo de un modelo de estudio de métodos terapéuticos con aplicación clínica. El principal problema a investigar en este proyecto fue, una vez desarrollado el modelo experimental de cáncer oral, determinar el momento de aparición y la morfología de los mastocitos en relación con los cambio displásicos iniciales de la mucosa lingual

Objetivos

Desarrollar un modelo de cáncer oral en ratas. Determinar la morfología y características particulares de las células cebadas (mastocitos) en el área peritumoral de lesiones tumorales iniciales de mucosa lingual.

Hipótesis de Trabajo

Las células cebadas (mastocitos) son atraídas a la región de lamina propia peritumoral sub-basal, antes de que las célula tumorales atraviesen la membrana basal. La morfología de los mastocitos se modifica en las áreas peritumorales.

Metodología

Se utilizó 4-NQO (4-nitroquinoline-1-oxide) para inducir tumores en la mucosa oral en ratas de acuerdo a protocolos previamente establecidos (5,8).. Se seguió las guías de cuidados de animales de laboratorio sugeridas por CICUAL (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Experimentación). La solución se incorporó al agua de bebida con una concentración de 5 ppm. Las lesiones tumorales fueron extirpadas bajo anestesia, y las muestras fijadas para microscopia óptica convencional, inmunohistoquimica y microscopia electrónica. Las muestran siguieron la metodología de preparación utilizada previamente con éxito por nuestro equipo de trabajo. Cortes de de 5 a 7 micras fueron coloreados con toluidina y azul alcian-safranina lo que permitió detectar la presencia de mastocitos. En el caso de las reacciones de inmunohistoquimica, se utilizó el anticuerpo antriptasa de mastocito (lab. Imgenex ), y ,finalmente, para la observación en microscopio electrónico las muestras fueron incluidas en resina, y cortadas con ultramicrotomo para su observación. En todos los casos se obtuvieron registros fotográficos para su posterior análisis y estudio estadístico.

Resultados

Los resultados iniciales mostraron:

Microscópicamente: los primeros cambios se detectaron a partir del 4º mes de iniciado el experimento, con la aparición de lesiones blancas sospechosas sobre el dorso posterior de la lengua.

Microscópicamente se detecto aumento del número de mitosis en las capas basales e infiltrado inflamatorio en la lámina propia de la mucosa lingual afectada.

El número de mastocitos toluidina positivos (fig 1), y safranina positivos fue superior a los reportados en la mucosa lingual normal por nuestro equipo de trabajo en estudios previos.

 


Fig 1: mastocitos toluidina positivos en la lámina propia de la lengua estudiada.

Conclusiones

Se logró el desarrollo de un modelo experimental que esperamos sirva de base para futuros estudios con aplicación básica y clínica que puedan ser trasladables al ser humano. Deseamos que este trabajo contribuya al estudio de esta patología tan conflictiva para la población humana.

Bibliografía

-Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P (2005) Global cancer statistics,2002. CA Cancer J Clin 55(2):74–1082-Boffetta P, Hashibe M (2006) Alcohol and cancer. Lancet Oncol7(2):149–1563 -Cooper JS, Pajak TF, Forastiere AA, Jacobs J, Campbell BH, SaxmanSB, Kish JA, Kim HE, Cmelak AJ, Rotman M, Machtay M,4-Eulderink F (1972) Experimental mesenchymal jaw tumors in mice.Ned Tijdschr Geneeskd 116(21):903–9045 -Kanojia D, Vaidya MM (2006) 4-Nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol 42(7):655–6676 -Wallenius K, Lekholm U (1973) Oral cancer in rats induced by the water-soluble carcinogen 4-nitrochinoline N-oxide. Odontol Revy 24(1):39–487 -Suzuki R, Kohno H, Suzui M, Yoshimi N, Tsuda H, Wakabayashi K,Tanaka T (2006) An animal model for the rapid induction of tongue neoplasms in human c-Ha-ras proto-oncogene transgenic rats by 4-nitroquinoline 1-oxide: its potential use for preclinical chemoprevention studies. Carcinogenesis 27(3):619–6308 -Schoop RA, Noteborn MH, Baatenburg de Jong RJ (2009). A mouse model for oral squamous cell carcinoma. J Mol Hist 40:177–1819-Aromando RF, Trivillin VA, Heber EM, Pozzi E, Schwint AE, Itoiz ME (2010). Early effect of boron neutron capture therapy mediated by boronophenylalanine (BPA-BNCT) on mast cells in premalignant tissue and tumors of the hamster cheek pouch. Oral Oncol. 2010 May;46(5):355-9. Epub 2010 Mar 2110 -Michailidou EZ, Markopoulos AK, Antoniades DZ (2008) Mast cells and angiogenesis in oral malignant and premalignant lesions.. Open Dent J. Nov 28;2:126-32.